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草鏈脲佐菌素 (Streptozotocin，STZ)-糖尿病動(dòng)物模型造模

1. STZ誘發(fā)糖尿病動(dòng)物模型的原理

STZ對(duì)一定種屬動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，能誘發(fā)許多動(dòng)物產(chǎn)生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造動(dòng)物模型。I型糖尿病與II型糖尿病動(dòng)物模型的制備與STZ注射的劑量有關(guān)系：大劑量注射時(shí)，由于直接引起胰島β細(xì)胞的廣泛破壞，可造成I型糖尿病模型；而注射較少量STZ時(shí)，由于只是破壞一部分胰島β細(xì)胞的功能，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，同時(shí)給予高熱量飼料喂養(yǎng)，兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出病理、生理改變都接近于人類II型糖尿病的動(dòng)物模型。國內(nèi)外有學(xué)者報(bào)道選用雄性大鼠制造模型的成模率明顯高于雌性大鼠。

2. 糖尿病模型動(dòng)物的選擇（體重，周齡，性別）

2.1 I型糖尿病（Type I diabetes）動(dòng)物選擇

一般按照體重選擇即可，推薦大鼠170-200g，小鼠17-22g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1~2周后空腹注射STZ，成模率相對(duì)理想?！窘?jīng)驗(yàn)顯示動(dòng)物體重過高，比如當(dāng)大鼠超過300g或小鼠超過35g，對(duì)STZ的耐藥性加強(qiáng)，成模率隨之降低。不建議使用超重的動(dòng)物建模?！?/span>

建議全部選擇雄性動(dòng)物，除非是實(shí)驗(yàn)方案有特定要求。有研究顯示，雌性動(dòng)物成模率差，而且可能會(huì)比雄性出現(xiàn)更高死亡率，尤其是I型。

2.2  II型糖尿病（Type II diabetes）動(dòng)物選擇

對(duì)于大鼠（比如SD/Wistar），選取4-5周齡，體重在90-100g，高脂（高糖）飼料喂養(yǎng)4-6周體重約達(dá)240-280g。 對(duì)于小鼠（比如C57/ICR/昆明小鼠），選取4-5周齡，體重在16-20g，高脂（高糖）飼料喂養(yǎng)4-6周體重約達(dá)30-35g。 對(duì)于新購入動(dòng)物或更換飼養(yǎng)環(huán)境需要先用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，然后再選擇適合周齡/體重動(dòng)物轉(zhuǎn)用高脂高糖飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。從模型建立成功率來看，大鼠推薦用SD，小鼠推薦C57。 建議全部選擇雄性動(dòng)物，除非是實(shí)驗(yàn)方案有特定要求。

3. STZ給藥前動(dòng)物的喂養(yǎng)

3.1Ⅰ型糖尿病模型：因成模比較快，通常動(dòng)物在普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1-2周后即可開始造模

3.2Ⅱ型糖尿病模型：高脂高糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)加小劑量STZ。造模前喂以高脂（高糖）飼料4-6周，誘發(fā)出胰島素抵抗，再注射STZ。

4. 高脂（高糖）飼料

高脂（高糖）飼料基本要求：含10%蔗糖，10%豬油，5%膽固醇。由基礎(chǔ)維持飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按比搭配制作高脂高糖飼料：其比例為豬油18 % ,蔗糖20 % ,蛋黃3 % ,基礎(chǔ)飼料59 %。飼料的成分比不是絕對(duì)的，可為了迎合口感，根據(jù)動(dòng)物愛好，增加一些成分如豬油或全脂奶粉。

5. 預(yù)實(shí)驗(yàn)的重要性

非常重要。實(shí)驗(yàn)時(shí)STZ的給藥量應(yīng)參照預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來確定，盡量不要盲目按照文獻(xiàn)上或他人的給藥量來直接使用。因?yàn)閯?dòng)物均重和空腹（低糖狀態(tài)）抗藥力、禁食時(shí)長、注射手法、以及之前飼養(yǎng)過程、測(cè)糖選時(shí)等都不相同，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定符合自己實(shí)驗(yàn)情況的給藥劑量，才是最科學(xué)的。

6. 常用給藥劑量（STZ）

動(dòng)物體重不同，STZ給藥量也不同。一般情況STZ劑量（mg/kg）高低和體重大小呈反比。

1200g均重大鼠為例，I型糖尿病，可用70~65mg/kg一次性給藥（或分次注射如35mg/kg，2次）。

以250g均重大鼠為例，II型糖尿病，先喂養(yǎng)4-8周的高脂（高糖）飼料，可用35~50mg/kg一次給藥。

以20g均重小鼠為例，I型糖尿病，可用150-220mg/kg一次性給藥（或分2次，100mg/kg）。

以30g均重小鼠為例，II型糖尿病，先喂養(yǎng)4-8周的高脂（高糖）飼料，可用70~120mg/kg一次給藥。

      給藥劑量是影響成模率的最大因素，以上僅做參考。具體劑量請(qǐng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來確定。

7. 一次給藥和多次給藥的選擇

假如需要給藥150mg/kg，可每次給藥50mg/kg，連續(xù)給3次。需注意的是與一次給藥（150mg/kg）相比，多次給藥造成動(dòng)物死亡率可能得到緩解，但STZ對(duì)胰島細(xì)胞的破壞力不如一次給藥明顯。換句話說，多次給藥可能減少死亡，但是一次注射效果明顯。建議根據(jù)動(dòng)物品種和耐受能力來決定給藥次數(shù)。目前大部分用戶采用一次給藥。

8. 多次給藥方式的選擇

大劑量STZ注射后，藥力發(fā)揮主要集中在注射后的3-72h。如果采用多次給藥，建議在2-72h內(nèi)延續(xù)第二次給藥，目前大部分用戶選擇24h為給藥周期居多。小劑量給藥STZ，當(dāng)使用劑量偏低（低于理想值），動(dòng)物可能在第二周出現(xiàn)血糖緩慢提升跡象，但隨著血糖峰值放緩且后延，有出現(xiàn)血糖先高后低、最終回落的可能。 多次給藥的總次數(shù)1-7次都有用過。總體上，1次和3次用的偏多。

9. 禁食和血糖的關(guān)系

      禁食12h以上（一般過夜禁食，不禁水）。禁食的時(shí)間越長，STZ對(duì)胰島β細(xì)胞的破壞力越明顯，即藥效越高。所以相對(duì)禁食時(shí)間延長，可以降低STZ的用量。

10. STZ注射液的配置

10.1  STZ溶液的選擇

配制STZ選擇的溶液推薦用檸檬酸緩沖液，此緩沖液的pH范圍能很好的控制在4.2~4.5，STZ在此pH范圍內(nèi)藥效最佳。當(dāng)然，也可使用其他溶液比如醋酸等，但pH值不好控制。

10.2  檸檬酸緩沖液的配制

稱取2.1g 檸檬酸（Mw: 210.14）加入雙蒸水100mL充分溶解中配成A液；

稱取2.94g 檸檬酸鈉（Mw: 294.10）加入雙蒸水100mL充分溶解中配成B液；

將A、B液按比例混合（1：1.32，也有按1:1），pH計(jì)測(cè)定并調(diào)節(jié)pH=4.2-4.5，用0.22μm或0.45μm濾膜過濾除雜，即是配置STZ的檸檬酸緩沖液。根據(jù)實(shí)際需要等比縮小或放大配制，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用以防止氧化引起pH漂移。ate-ammonium）是一種毒性低，活性高，廣譜的非選擇性除草劑，其有效成分是草丁膦（phosphinothricin，PPT）。PPT是谷氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，干擾氨基酸和谷氨酰胺的合成。正是谷氨酰胺的短缺導(dǎo)致機(jī)體無法進(jìn)行氨解毒，光合作用受抑制，最終導(dǎo)致植物死亡。

【注意事項(xiàng)】：

a) 如果緩沖液配好后pH值不在范圍內(nèi)如何調(diào)節(jié)？—偏酸用檸檬酸鈉（或雙蒸水）調(diào)整，偏堿用檸檬酸調(diào)整。
b）緩沖液是否需要過濾？—必須過濾

c）緩沖液是否需要滅菌？—滅菌是否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，這個(gè)沒有實(shí)際的數(shù)據(jù)。如果條件允許，靜脈注射最好滅菌（120℃，20min）；腹腔注射可做可不做。
d）緩沖液是否能儲(chǔ)存再用？— 可以，但使用前需再次測(cè)pH值，確保合乎范圍。建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

11.STZ注射操作事宜 

    過夜禁食后稱重，按動(dòng)物數(shù)目和注射劑量來計(jì)算，稱取所需的STZ（凍干粉），放到一干燥的無菌瓶內(nèi)，用鋁箔或錫箔紙包好。將檸檬酸緩沖液和裝STZ的瓶子提前置于冰浴中，一起帶到動(dòng)物房。 按照1%（w/v）濃度加入適量的檸檬酸緩沖液溶解STZ，充分溶解。按照動(dòng)物空腹體重注射相應(yīng)體積的STZ， 需在30min內(nèi)注射完畢。對(duì)于注射技術(shù)不是很熟練，建議兩組交替注射，分組溶解STZ，比如10只鼠/組或15只鼠/組。

12. 注射時(shí)，推進(jìn)速度與血糖關(guān)系 
    一般來說，推注速度快，更容易形成高血糖；推注速度慢，相對(duì)危險(xiǎn)性較低。常規(guī)操作中多要求快速注射。當(dāng)然，STZ劑量是決定血糖高低的主要因素。

13. 腹腔注射和靜脈注射的區(qū)別 
    靜脈注射（尾靜脈注射）藥物利用率高，與腹腔注射相比，可以節(jié)省藥量，但操作起來不如腹腔注射方便。

14. 未達(dá)標(biāo)模型如何補(bǔ)救 
    模型不達(dá)標(biāo)者，穩(wěn)定后補(bǔ)注STZ（以10mg-20mg/kg體重劑量腹腔注射，根據(jù)實(shí)際情況選擇合適劑量）也可以成模。或者待血糖恢復(fù)正常后再按常規(guī)劑量注射。但想要達(dá)到理想的效果，往往是恢復(fù)到正常狀態(tài)下重新造模。

15. 如何解決死鼠問題 
     鼠的個(gè)體差別和空腹（低血糖）抵抗力的差異而致死亡率的不同，開始死亡率高可能主要是血糖突然升高，鼠不適應(yīng)，或發(fā)生了糖尿病酮癥酸中毒(diabetic ketoacidosis, DKA)。要解決死鼠問題，可通過以下方式來降低或避免死亡：
     a）一定要保證足夠的飲水量（飲水量不足容易導(dǎo)致死鼠）
     b）高血糖和低血糖都會(huì)造成死鼠，避免死鼠可以通過注射胰島素或暫時(shí)補(bǔ)糖，兩種途徑： 1）常見為血糖過高。使用補(bǔ)胰島素法，補(bǔ)一些中效胰島素，例如中性低精蛋白鋅人胰島素（諾和靈N），每次2-3個(gè)單位，過了3-5天，大鼠一般死亡率就低了；2）補(bǔ)糖法，禁食后的鼠，注射的時(shí)候已經(jīng)處于低血糖狀態(tài)，造模4小時(shí)后腹腔注射20%葡萄糖，可避免因注射時(shí)血糖過低引起的死鼠。

     c）防止動(dòng)物自相殘殺。食物缺乏和供水不足的情況下，會(huì)互相撕殺、啃食同類,所以食物和飲水要供應(yīng)充足,最好是兩路供應(yīng)。

     d）防止感染。糖尿病大鼠尿量多，墊料潮濕，需要勤換墊料，所以糖尿病鼠較其他鼠更易出現(xiàn)感染，特別是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血測(cè)血糖等侵入性操作前后，要注意消毒工作。如每次采血測(cè)血糖后可用四環(huán)素（或金霉素眼藥膏）局部涂抹處理傷口預(yù)防感染。

16. STZ保存和稱量注意事項(xiàng) 
    保存：STZ置于-20℃凍存，避光干燥，可穩(wěn)定至少保存2年?！居袛?shù)據(jù)測(cè)試取一瓶按要求保存12年的STZ樣品，HPLC檢測(cè)顯示期內(nèi)的α-anomer由原來的94.9%減低到94.7%，穩(wěn)定性還是很理想的?！?/span>
    稱量：由于STZ比較容易受潮，在反復(fù)稱量郭晨中很容易接觸到空氣中潮氣，其受潮30min后會(huì)失效，這和注射時(shí)要求快速注射也是一個(gè)道理，STZ水溶液也不是很穩(wěn)定。為此，盡量避免反復(fù)稱量，第一次使用本品可根據(jù)估算的單次用量分裝（操作環(huán)境、盛裝容器、分裝工具都必須保證干燥）。分裝后用封口膜密封瓶口。用鋁箔紙或錫箔紙避光包好，放入干燥罐內(nèi)（含干燥劑），-20℃凍存。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。